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明星抗癌药紫杉醇:跌宕起伏的研发故事

来源(药事纵横(ID:Pharmaguider))   2019-03-05
导读:紫杉醇为红豆杉中提取的天然产物,通过作用于微管蛋白抑制肿瘤细胞有丝分裂,为紫杉烷类的典型代表,是获得FDA批准的第一个来自天然植物的化学药物,可用于治疗多种癌症,包括卵巢癌、乳腺癌、肺癌、卡波氏肉瘤、宫颈癌和胰腺癌。紫杉醇独特的作用机制决定了该药几乎适应于所有实体瘤,也正是这一特质吸引了无数科学家对紫杉醇的垂青。从1967年紫杉醇首次被发现,到替尼、单抗以及免疫治疗漫天飞舞的今天,围绕紫杉醇的研发从未停止,而且愈演愈烈。

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紫杉醇的发现

1960年,美国国立癌症研究所(National Cancer Institute,NCI)与农业部(the United States Department of Agriculture,USDA)成立了一个合作项目:采集和筛选植物样品以发现可能有药用价值的天然化合物。此后的20年间,研究人员总共收集并测试了3万多个样本,就是在这样的规模浩大的抗癌药物筛选工程中,一个迄今为止最优秀的天然抗癌药物诞生了!

1962年8月,一个炎热的夏日,美国农业部植物学家亚瑟·巴克雷(Arthur Barclay),带着他的3个研究生,来到华盛顿州的吉福德·平肖国家森林为NCI收集植物样本。站在1500英尺高的地方,巴克雷发现了一株25英尺高的太平洋红豆杉树,他们采集了太平洋紫杉的树枝、树皮和果实样本。

当时这种杉树还不太为人所知,这种籍籍无名也使其显得不重要。它中等高度,树皮呈红紫色,其针状叶细而扁平,轻微弯曲,不到一英寸长。它通常藏身在溪流岸边、深谷或潮湿的沟壑之中,掩映在高大的松类树木的荫蔽之下。其木材既硬又重,腐败缓慢,用途有限。在它的抗癌作用被发现之前,林木工人们通常砍伐了这些树后当柴烧,或者打树桩当篱笆,把它当成一种“垃圾树”(trash tree)。

巴克雷的这批样品被送到威斯康星校友研究基金会进行提取。树皮的粗提物对KB细胞有毒性作用,该结果引起了NCI的注意。1964年9月8日,巴克雷又回到吉福德·平肖国家森林收集了30磅短叶紫衫的树皮并寄给了NCI。这些宝贵的原材料辗转又到了北卡三角研究院,在这里,它与两个著名的化学家相遇了,他们就是沃尔(Monroe Wall)和瓦尼(Mansukh Wani)。

沃尔和瓦尼在收到这些树皮后,小心翼翼地把这些树皮研磨、一步步地进行提纯,得到一种粗提取物。他们发现这种粗提取物对离体培养的肿瘤细胞,包括L1210和P288白血病,Walker 256肉瘤及B16黑色素瘤细胞都具有很强的抑制作用,便开始从粗提取物中分离抗癌活性成分。1966年9月,沃尔和瓦尼经过反复地尝试后,终于从12kg短叶紫衫干树皮中提纯得到0.5g活性成分。因为当时还没有搞清楚这种物质的具体结构,但他们知道这种物质肯定含有羟基(醇类所含有的基团);又因为它是从太平洋紫杉(Taxus brevifolia)中获得的,所以他们把这种物质称为紫杉醇(Taxol)。

紫杉醇提取纯化全过程

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1967年,在美国化学会的年会上,瓦尼做了报告,跟大家展示了紫杉醇的细胞毒性和抗肿瘤活性研究结果。但是,由于紫杉醇的结构还没有搞清楚,并且它的提纯产率非常低,又因为NCI在那个年代筛选了一大批抗癌药物,这其中就包括沃尔和瓦尼发现的喜树碱,而且NCI在那时已经在准备开展喜树碱的临床试验了。

所以,沃尔打算暂时把紫杉醇放一放。不过,瓦尼不同意,他坚持在“低优先级”的状态下,继续开展紫杉醇研究。瓦尼的坚持给紫杉醇带来了活路,终于在1969年,紫杉醇通过了NCI严格的抗癌药物筛选程序,成为了官方认可的潜在抗癌药物。

1970年初,通过使用晶体的X光衍射技术和核磁共振技术,沃尔和瓦尼终于完全解析了紫杉醇的结构式。他们发现其结构骨架与从其它各种紫衫属杉树中得到的几种化合物的基本结构相似,都属于紫杉烷类环状体系,它包含一串并连在一起的两个六元环夹着一个八元环,再一个四元环,环上缀了个小“尾巴”。紫杉醇一共有11个立体中心,多个功能团,如是复杂,是一种只有自然界才能调制出的“怪物”。

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紫杉醇结构式

1971年5月,沃尔和瓦尼在美国化学会杂志(Journal of the American Chemical Society,JACS)上发表通讯报道了这个初显抗肿瘤活性的天然化合物;相比其它各种紫杉属杉树中得到的化合物,只有紫杉醇显示了这一独特生物活性。他们的发现引起了全球科学家的关注。

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紫杉醇的作用机制

对于生物学家和病理学家们,他们好奇这个天然化合物有抗癌作用,想知道其作用机理。1978年,NCI的两名研究人员发现,紫杉醇能够让细胞停滞在G2-M期,抑制细胞的有丝分裂。这似乎意味着,紫杉醇跟秋水仙碱、长春花碱、美登木素等一样,都是一类具有微管蛋白抑制作用的药物。

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紫杉醇在细胞周期中的有丝分裂期作用

1979年,纽约叶史瓦大学(Yeshiva University)的分子药理学家霍尔维茨(Susan B. Horwitz)发现紫杉醇的抗癌机理独特,有别于在此之前发现的其它抗癌试剂。在细胞有丝分裂时期,纺锤体需要作为细胞骨架的微管解聚才能形成,而染色体也只有在纺锤体和纺锤丝的牵引下向两极移动才能完成有丝分裂。她发现紫杉醇能促进微管蛋白聚合,抑制微管解聚,致使不能形成纺锤体和纺锤丝,从而不能牵动染色体向细胞两极移动,使细胞不能完成有丝分裂,导致微管成束而致使细胞凋亡于G1-G0期。另一环节,在S-G2期,微管发生中心(micro tubules organizing center, MOTC)进行复制,即由一个MOTC复制成两个MOTC。此时在紫杉醇作用下,细胞微管形成无序排列的星状体,则细胞在G2-M期死亡。

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抗癌与环保之争

在沃尔和瓦尼公布紫杉醇的分子结构之后,NCI的管理层似乎对紫杉醇有点感兴趣了。不过,紫杉醇原料的供应却是他们不得不考虑的问题,因为要开展紫杉醇的动物试验、毒理实验和以后的临床试验,都需要大量的紫杉醇。在细胞测试阶段,紫杉醇用量较小,因此紫杉的消耗量也小。刚发现紫杉醇的活性时,沃尔用了21千克紫杉树皮和枝叶。到1966年底,沃尔的需求达到了170千克,但是每12千克干样中大约只能萃取出0.5克紫杉醇,好比大海捞针。

起初巴克雷鉴定树种、收集枝叶样品,只是一个植物学家的行为,后来所需原材料量越来越大,从7千克到170千克,已经超越了植物学的范畴。NCI为得到更多的样品,不得不与管理森林和土地的政府部门打交道。

1980年,当紫杉醇进入到动物实验阶段,对原材料的需求更是达到了10吨。然而短叶紫杉生长极其缓慢且不易繁殖,一棵树龄约为125年的紫杉,其直径约为22厘米、高约9米,但其树皮极薄,厚度为0.3~0.6厘米,只能得到2千克左右的树皮。此外,紫杉醇必须从新鲜砍伐剥取的树皮中提取。因此,从砍伐树木,收集紫杉树皮到分离萃取出紫杉醇,费时费力且费钱。

因为当时天然紫杉醇难以得到,30吨干树皮才能得到大约100克紫杉醇,成本高达150万美元。因为原料缺乏,NCI从1983年才开始人体临床试验,直到1989年NCI也才得到了不足3千克紫杉醇。

1983年的首次临床试验结果良好,1989年约翰斯·霍普金斯(Johns Hopkins)大学的研究人员发现紫杉醇对黑色素瘤的疗效非常显著,更重要的是,它对复发性卵巢癌的有效率高达30%。这在当时简直是爆炸性新闻,因为那个时候,对于复发的卵巢癌还没有什么有效药物,紫杉醇一跃成为明星药物,太平洋紫杉也随之变成了举世瞩目的抗癌药材。

为了得到紫杉醇救治癌症病人,就需要砍伐树木,从而导致树木死亡。据NCI推测,若用紫杉醇治疗全美国的黑色素瘤和卵巢癌患者,那么每年需要砍伐36万棵紫杉树。救人还是保树,面临两难抉择。环保主义者们认为太平洋紫杉生长缓慢,天然更新的能力很差,如果大量砍伐,紫杉将会濒临灭绝。此外,环保主义者还发现紫杉是一种濒临灭绝的斑点猫头鹰的栖息所,如果肆无忌惮地砍伐紫杉树,还会同时威胁斑点猫头鹰的生存。

在八十年代末期到九十年代初期,关于紫杉醇和紫杉的新闻报道比比皆是,完全超越了科研范畴,成为了敏感的政治事务。直到半合成紫杉醇方法的出现,才使得继续开发紫杉醇成为可能。

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紫杉醇的合成

一、紫杉醇的全合成

由于紫杉醇对乳腺癌和卵巢癌神奇的疗效、独特的抗癌机制、新颖的结构以及有限的自然资源,从而引起了全世界研究者的强烈关注。许多合成化学家对紫杉醇复杂而新颖的结构非常有兴趣,将合成紫杉醇看作是基辅刺激的挑战。全世界范围内约有四十多个一流的研究团队从事紫杉醇全合成研究工作,实属罕见。目前已有6个研究团队公开报道完成了具有各自特点的紫杉醇全合成路线。

1994年斯克瑞普斯研究所(The Scripps Research Institute,TSRI)的化学家K.C. Nicolaou和佛罗里达州立大学(Florida State University)的化学家Robert A. Holton几乎同时宣告紫杉醇的全合成获得了成功,1996年S. T. Danishefsky、1997年P. A. Wender、1998年 I. Kuwajima和1999年T. Mukaiyama也先后完成了紫杉醇的全合成工作。6条全合成路线虽然各异,但都具有优异的合成战略,把天然有机化学合成提高到一个崭新的水平。

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Holton紫杉醇全合成路线

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Nicolaou紫杉醇全合成路线

然而这些全合成方法路径太长、合成步骤太多(最少37步),不仅需要使用昂贵的试剂,而且反应条件极难控制,合成的总体收率也非常低——最高产率不超过2%,因此并不适合工业化生产。

二、紫杉醇的半合成

1981年,法国科学家Pierre Potier,从英国紫杉的叶子中分离得到了一种叫做10-DAB(10-deacetylbaccatin Ⅲ)(图6)的物质,它跟紫杉醇的结构非常相似,只是缺少一些侧链基团。10-DAB是从一种常见的欧洲红豆杉的枝叶中分离出来的,其含量可达0.1%。由于枝叶再生能力强,采集枝叶不会对该物种的生存造成影响。

1988年,法国Denis等首次报道了以10-DAB为原料半合成紫杉醇。其后,美国Holton教授和法国Potier教授等以Baccatin Ⅲ为原料半合成了紫杉醇。紫杉醇半合成反应路径短,产率高,为紫杉醇的工业化生产提供了可行的方法。1994年,BMS采用Holton教授半合成方法的专利生产紫杉醇。1997年,半合成紫杉醇被FDA批准上市。

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10-DAB结构式

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紫杉醇的临床开发


除了来源问题,还有另外一个问题也限制了紫杉醇的开发。从结构式就可知,紫杉醇是疏水性物质,其水溶性非常差,需要用有机溶剂进行溶解。Cremphor EL和乙醇可制备紫杉醇制剂,但这两种溶媒可能会导致毒性,如犬血压下降。另一个更为严重的问题是第一批病人接受紫杉醇制剂后出现了超敏反应。实际上,首批接受紫杉醇制剂(Taxol®)治疗的一个患者因过敏性休克而死亡,这足以阻止大多数药物进一步的临床研究。

从1983年至1988年,科学家们未再继续开展紫杉醇相关的临床试验。在此期间,肿瘤学家、制剂化学家和药理学家一起努力寻找过敏反应的解决方案,以便继续开展临床试验。为防止发生过敏反应,受试患者在给予紫杉醇制剂之前先给予抗组胺药和类固醇,且不再是静脉推注给药,而是静脉滴注 24 小时给药。采用预处理后再给药的方案,实验结果显示紫杉醇对难治性卵巢癌和转移性乳腺癌有良好的临床效果。

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图片来源:科睿唯安

尽管所有的临床研究都是 NCI 在主持下开展的,但它毕竟不是一个制药公司,无法进一步开发这个药物。由于药物的化学结构和作用机制都没有进行专利保护,因此对制药公司没有吸引力。NCI发布了合作研究的广告,最终BMS以其开发抗癌疗法上的强项赢得合作。

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BMS的印钞机

Taxol®为全球第一个上市的紫杉醇制剂,1992年12月首次登陆美国市场。经过BMS近10年努力,其适应症不断由二线向一线拓展。目前,Taxol®为“晚期卵巢癌、NSCLC、Her2阳性转移性乳腺癌”三大适应症的一线用药。如此强悍的适应症在给BMS带来丰厚利润的同时,也奠定了其全球肿瘤领域的“领头羊”地位。

从1992年上市以来,Taxol®销售额直线飙升,于2000年达到销售巅峰(15.9亿美金)。截至2017年年底,Taxol®总共给BMS带来了至少超过145亿美金的销售收入。

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紫杉醇的后继改良

一、紫杉醇的改良制剂

作为第一个紫杉醇制剂,Taxol®在市场上取得了巨大的成功,但该药有一个非常明显的缺陷:溶媒中使用了聚氧乙烯蓖麻油。这一变应原能够刺激机体释放组胺,导致过敏反应,这就导致了Taxol®的两大临床问题:Taxol®背上了“过敏及严重过敏反应2%-4%发生率”的黑框警告;用药前必须经过皮质激素及抗组胺药等预处理。当然,也正是该缺陷给紫杉醇的后续开发留下了广阔的空间,成功上市的有紫杉醇脂质体(力朴素)、白蛋白结合型紫杉醇纳米粒(Abraxane®)等。

Abraxane®凭借其广泛的适应症及较低的不良反应铸就了紫杉醇的又一个辉煌,自2005年上市以来的10年间,Abraxane®已经创造了至少超过50亿美金的全球销售额。

表1.已上市的紫杉醇制剂

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二、多西紫杉醇

Potier在探索用10-DAB合成紫杉醇的过程中,发现一个名叫RP5676的中间产物,距离紫杉醇还有两步。Potier在对这个中间产物进行活性测试时,发现RP5676比紫杉醇有着更强的微管蛋白结合能力。这个中间产物,后来就成为了赛诺菲的抗癌药,多西他赛(Docetaxel),又名多西紫杉醇。

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多西他赛结构式

多西他赛跟紫杉醇结构上非常相似,有着相同的母核,只是有两个基团跟紫杉醇不一样,这也让多西他赛的溶解性更好。值得一提的是多西他赛虽然在水溶性方面要比紫杉醇好一些,但还是得用吐温-80和乙醇作为溶剂,也比较容易引起过敏反应,所以它在使用前也是需要用抗过敏药物。

1996年,多西他赛获得美国FDA的上市批准用于治疗晚期乳腺癌,后来又被批准用于治疗非小细胞肺癌、前列腺癌、胃腺癌等。多西他赛上市后,其销售额很快就超过了Taxol®。在2010年的时候,多西他赛的年销售额高达21亿欧元,同一年,多西他赛专利到期,这之后很多仿制药纷纷上市。

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结语

从紫杉树到一个个明星抗癌药Taxol、Taxotere、力朴素和Abraxane,无一不凝聚着无数科学家的智慧和汗水。未来,紫杉醇和多西紫杉醇还是否继续书写其传奇,我们拭目以待。


参考文献

1. The Discovery of Camptothecin and Taxol, April 23, 2003

2.Mansukh C. Wani, Susan Band Horwitz. Natureasa Remarkable Chemist: A  Personal Story of the Discovery and Development of Taxol®. Anticancer Drugs. 2014 May; 25(5): 482–487.

3.阎家麒,王九一. 紫杉醇半合成及其产业化

4.李力更,吴明,史清文,天然抗癌药物紫杉醇的全合成。天然药物研究与开发,2008,20.1104-1107,1113

5.紫杉醇升级之路:全球改良型新药的典范

6.抗癌药紫杉醇(Taxol)的故事

7.毒树、凶器、天然抗癌药典范——紫杉醇的前世今生