Figure 1. Lipstatin逆合成分析（图片来源：J. Am. Chem. Soc.）

KAS-III是典型的同源二聚体，可以催化各种基于硫酯的反应。最常见的KAS-III（如FabH in Escherichia coli），通常催化的是乙酰-CoA与丙二酰-ACP之间的脱羧形式的Claisen缩合（Figure 2）。

Figure 2. FabH催化的脱羧缩合反应（图片来源：J. Am. Chem. Soc.）

最近报道了一些另一种类型KAS-III，可以催化非脱羧形式的缩合反应。目前报导的这两种（脱羧、非脱羧）KAS-III均是以同源二聚体的形式来催化反应。本文作者在Lipstatin生物合成中，发现了另一种全新的KAS-III：LstA、LstB以异源二聚体的形式来催化缩合反应，LstA、LstB共同催化C8与C14乙酰-CoA发生非脱羧形式的缩合，形成C22的脂肪骨架（Figure 3）。

Figure 3. LstA、LstB共同催化缩合反应 （图片来源：J. Am. Chem. Soc.）

LstA、LstB以异源二聚体形式存在的发现：作者单独表达LstA、LstB均无法获得可溶性蛋白，但是共表达，却能够获得可溶性蛋白。因此作者推测LstAB可能存在相互作用，经过多角度光散射（multiangle light scattering，MALS）分析确认这两个蛋白的确通过非共价连接的方式形成了异源二聚体。

LstAB催化非脱羧缩合的验证：C22长链骨架的构建，推测是C9长链与C14乙酰-CoA以脱羧的方式缩合，但实验表明化何物1-CoA对于构建C22长链骨架是必须的，而且体内敲除负责催化脱羧缩合的酶Acyl-CoA carboxylase (ACCase)，Lipstatin的产率降低了80%，而且中间体2（Figure 1）也有所积累，但是随后的同位素标记实验发现，相比于化合物2 ,化合物3整合到Lipstatin中的量很低，因此作者推测化合物2很有可能不是缩合反应的直接前体。不要用红色突出，微信中编辑后都看不出来了，要突出可以加粗

随后作者合成了2-CoA，5-CoA，其中5-CoA可以在AntE的催化下转化成3-CoA（Figure 5B,ⅠⅡ）,如果同时加入AntE，LstAB，最终可以检测到化合物6（major）以及7（Figure 5B,Ⅳ）。随后作者以1-CoA与2-CoA为底物，在LstAB催化下测活，仅检测到了化合物6。基于以上实验结果，作者推测了以下可能的过程，LstAB可以催化化合物1-CoA及5-CoA与2-CoA发生非脱羧的缩合反应，其中 1-CoA与2-CoA为LstAB主要催化的的反应，化合物6及7可能是化合物4和8不稳定，发生脱羧的产物（Figure 4）。

Figure 4. LstAB体外测活及HPLC检测结果（图片来源：J. Am. Chem. Soc.）

不稳定中间体4的追踪：作者在进行LstAB催化1-CoA与2-CoA缩合反应的时间梯度实验中，检测到了两个化合物4-Ⅰ,4-Ⅱ（Figure 5A），且两个化合物不稳定，在30 min时产量达到最大值，随后可能发生了降解，作者认为最有可能是化合物6未发生脱羧的前体。原本推测为1- CoA与2- CoA以两种不同方式缩合产生的中间体4, 4’（Figure 5B, route a, route b）。但是化合物 4’ 与Lipstatin中C22长链骨架不符，因此推测这两个峰最有可能是化合物4的异构体，经过串联质谱解析，4-Ⅰ,4-Ⅱ的裂解方式是一致的，与作者的推测相符。

 Figure 5. A）LstAB催化1-CoA与2-CoA的缩合反应的时间梯度实验 B）1-CoA与2-CoA两种可能的缩合方式（图片来源：J. Am. Chem. Soc.）

识别LstAB的催化残基：作者将LstAB与之前已经报导过的KAS-III-FabH进行序列比较，发现LstA中包含保守的催化三联体Cys128α, His271α, Asn305α。作者将LstA中的催化三联体分别进行了突变，其中LstA_N305ALstB无法获得可溶性蛋白，因此推测Asn305α在LstALstB复合物中起着结构性作用。LstA_C128ALstB，LstA_H271ALstB失去了其原本的催化活性（Figure 6），作者认为，Cys128α很有可能负责与C8的共价连接。催化非脱羧KAS-III蛋白中均有一个保守的Glu残基来进行α-C的去质子化，作者以此为参考，将LstAB中的相应Glu进行了突变，发现LstAB_E60A失去了催化活性（Figure 6），因此推测LstB的Glu60β可能行使α-C的去质子化的功能。

 Figure 6. LstAB突变体测活结果（图片来源：J. Am. Chem. Soc.）

LstAB进化系统分析：作者利用生物信息学手段对lstAB进行了分析，lstA和lstB为什么斜体 同源基因广泛分布于各类细菌基因组中，这些发现表明LstAB这种以异源二聚体的形式催化非脱羧缩合的方式广泛存在于与Lipstatin类似的天然产物生物合成中。

基于以上研究，LstAB的催化机理总结如下：LstA的Cys128α与C8长链反应形成C8 acyl-Cys128α LstAB中间体，LstB的Glu60β进行去质子化引发后续的亲核加成反应（Figure 7）。

 Figure 7. 可能的LstAB催化机理（图片来源：J. Am. Chem. Soc.）

小结：上海有机所刘文课题组发现了在减肥药前体Lipstatin的生物合成路径中存在一种新型的KAS-III，以独特的异源二聚体的形式催化非脱羧的缩合反应，并对其催化机理进行了详细研究。这些发现对于Lipstatin类似物的生物合成研究有十分重要的指导意义。

撰稿人：超级玛丽