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JACS：共轭齐聚电解质分子实现对线粒体损伤过程的实时成像

来源：化学加原创      2024-01-24
导读：近日，新加坡国立大学化学与生物分子工程系Guillermo C. Bazan教授在设计合成线粒体靶向的共轭齐聚电解质分子方面取得新进展，相关研究成果以“Real-Time Monitoring of Mitochondrial Damage Using Conjugated Oligoelectrolytes”为题发表在Journal of the American Chemical Society上。本文报道了一种可以对线粒体进行荧光可视化的共轭齐聚电解质分子COE-CN。该分子以咪哗鎓作为增溶基团，以具有分子内电荷转移特性的光学活性氰乙烯基连接的二苯乙烯基为核心骨架。COE-CN较短的分子长度使其有利于靶向细胞的内部结构。流式细胞数据表明COE-CN可以用来识别线粒体损伤的细胞，在细胞的诊断分析中具有巨大的应用潜力。文章链接DOI: 10.1021/jacs.3c10531

正文

线粒体为各种生命活动提供能量，参与细胞分化和细胞凋亡等过程，在调节细胞功能方面发挥着重要作用。长时程活细胞探针和超分辨成像染料能够对线粒体的动态过程进行监测。其他类型的生物传感器可以检测电压、阳离子浓度、温度、极性和粘度等信息。由于线粒体膜电位（MMP）为负，含三苯基膦基团的探针、小分子阳离子染料如Rhodamine 123和TMRM常被用来构建线粒体靶向探针。染料积累和膜电位之间的相关性可以作为检测线粒体膜健康状态的指标。因此，开发高性能线粒体靶向探针对于理解细胞化学生物学至关重要。 膜插层共轭齐聚电解质分子（MICOEs）是一类具有光学活性共轭骨架的分子，其两侧是离子基团，疏水和亲水结构中的类脂质双分子层有利于嵌插到膜结构中，从而表现出特异性荧光发射。虽然如此，有关COE分子与细胞相互作用机制的研究很少被报道。COE-S6作为一种典型的阳离子低聚苯乙烯（oligo-PV）化合物，细胞共定位实验证明其不具有线粒体靶向特性，被细胞内吞后定位在溶酶体中（Scheme 1）。较短的阳离子COEs更倾向于与质膜结合。然而，疏水特性则有利于分子被细胞摄取，嵌插到膜结构中。基于此，作者设计了以咪唑作为增溶基团，氰乙烯基连接的二苯乙烯基为核心骨架的分子COE-CN。该分子可以对细胞器进行成像并可以对线粒体损伤的细胞进行区分。下载化学加APP到你手机，更加方便，更多收获。

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Scheme 1. COE-CN（线粒体靶向）、COE-S6（溶酶体靶向）和COE-BO（溶酶体靶向）的化学结构及其在细胞内积累的示意图

（图片来源：J. Am. Chem. Soc.）

作者合成了水溶性化合物COE-CN。相比于COE-S6，该化合物较短的分子链长和较大的总极性表面积（TPSA）将削弱其疏水特性，使分子不易于与质膜结合。如Figure 1a所示，COE-CN在磷酸盐缓冲液（PBS）和小单层囊泡（SUV）中的吸收峰位置分别位于392 nm和435 nm，PBS中分子的发射峰位置为525 nm。此外，COE-CN在SUV中的发射强度较高，也进一步说明分子在嵌插到极性小的脂质双分子层中的发光会增强（Figure 1b）。共聚焦细胞成像（CLSM）表明COE-CN在较短的染色时间内即可定位到HeLa细胞中的线粒体，而COE-S6探针只染色了细胞外围的结构（Figure 1c）。由于光谱存在重叠，作者选择COE-CN与COE-BO（溶酶体靶向染料）对细胞进行共染（Figure 1d）。从细胞染色速率和细胞器选择性的角度都能进一步证明COE-CN对质膜结构的染色效果较差。

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Figure 1. COE-CN的光学性能

（图片来源：J. Am. Chem. Soc.）

为了进一步考察COE-CN对线粒体的染色效果，作者将其与商用线粒体染料MitoTracker Red对细胞进行共染，共定位系数达到0.87（Figure 2a）。如Figure 2b-d所示，COE-CN与SYTO Deep Red（细胞核靶向染料）、CellMask Deep Red（细胞膜靶向染料）和LipidTOX Red（脂质靶向染料）共染的共定位系数分别为0.07,0.03和0.07，共定位效果较差，再次证明了COE-CN可实现对线粒体的高选择性靶向。

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Figure 2. COE-CN染色HeLa细胞的共聚焦图像

（图片来源：J. Am. Chem. Soc.）
通过对比COE-CN与商用染料被连续光照射前后的发光强度数据可知，该分子表现出良好的光学稳定性，与商用染料性能相当。

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Figure 3. COE-CN，MitoTracker Green （MTG），MitoTracker Red（MTR）和 MitoTracker Deep Red（MTDR）在染色HeLa细胞前后的光学稳定性比较

（图片来源：J. Am. Chem. Soc.）

接下来，作者对HeLa细胞进行处理以诱导线粒体自噬过程。线粒体自噬是以清除功能失调或多余的线粒体，从而调整线粒体数量和保持能量代谢的生理过程。作者将COE-CN与经溶酶体相关的膜蛋白（Lamp1-RFP）转染的细胞共培养。如Figure 4所示，在未经处理的细胞中，COE-CN能够呈现出线粒体正常的棒状形态。同时，溶酶体在共聚焦显微镜下为清晰的囊泡结构。相比之下，经处理发生线粒体自噬的细胞中，部分线粒体的结构开始破碎，再次证明了COE-CN可以作为高性能线粒体靶向探针用于观察活细胞中线粒体的实时生理过程。

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Figure 4. COE-CN染色（a）未处理和（b）CCCP处理的细胞图像

（图片来源：J. Am. Chem. Soc.）
最后，作者对COE-CN染色的细胞进行了流式细胞分析，以此检测免疫细胞的线粒体膜电位去极化变化和线粒体质量，从而预测免疫细胞的代谢状态（Figure 5）。处理过后的细胞群发生位移，COE-CN的强度有所下降。经MitoTracker Red染色的去极化细胞中的线粒体发光强度则没有明显变化。以上数据表明COEs系列化合物可以对不同化学成分进行分析，因而能区分细胞器的状态。

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Figure 5. COE-CN染色线粒体的流式细胞分析

（图片来源：J. Am. Chem. Soc.）

总结

新加坡国立大学化学与生物分子工程系Guillermo C. Bazan教授报道了一种可以快速靶向线粒体的COE衍生物COE-CN。该分子的特异性与多数报道的通过细胞内吞靶向到质膜或细胞内囊泡的方式有所差异。COE-CN能够对线粒体进行选择性成像，并能对线粒体损伤过程进行动态监测，表现出良好的发光强度和光学稳定性。在不同的细胞染色实验中，COE-CN依然能够保持足够的成像亮度。基于此，该探针有望作为细胞器靶向探针用于疾病的诊断当中。

文献详情：

Samuel J. W. Chan, Ji-Yu Zhu, Wilson Wee Mia Soh, and Guillermo C. Bazan*. Real-Time Monitoring of Mitochondrial Damage Using Conjugated Oligoelectrolytes. J. Am. Chem. Soc. 2023, https://doi.org/10.1021/jacs.3c10531

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